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    介紹酵母雙雜交的兩種構建方法

    發布時間:2021-07-25   點擊次數:787次
      酵母雙雜交技術作為研究蛋白質相互作用的主要方法,在規?;鞍踪|相互作用研究中占據舉足輕重的地位,已經成為分子生物學研究領域的重要實驗手段,因此有不少生物公司提供從構建雜交文庫到文庫篩選的一站式酵母雙雜交服務。但是酵母雙雜交技術的分子生物學操作是比較復雜的,包含從基因的載體構建、蛋白質的自激活檢測到多次酵母轉化和相互作用的確認,對酵母雙雜交技術進行改進,可以提高其工作效率。
      目前市場上提供的酵母雙雜交服務有核體系和膜體系兩種,酵母雙雜交與其他相互作用篩選手段相比,最大的優勢在于它能夠適應基因組水平的高通量篩選。美迪西提供酵母雙雜交服務,其具有獨立優質的實驗室和專業的實驗人員,提供詳細的酵母雙雜交實驗步驟、原始數據和圖片、結果分析,可以出具檢測數據報告。
      為了降低工作量使其更適用于高通量篩選,需要對酵母雙雜交技術進行改進,常采用的手段有酵母雙雜交陣列篩選技術和規?;d體構建方法。
      1、酵母雙雜交陣列篩選技術
      從傳統的酵母雙雜交技術基礎上發展而來的酵母雙雜交文庫篩選技術能夠支持一個誘餌與整個cDNA文庫的篩選,可以用于篩選一個蛋白質與整個cDNA文庫中的相互作用。但是該技術并不適用于基因組水平的相互作用篩選。
      首先,基因組水平的相互作用篩選需要成千上萬的誘餌,而對這些誘餌進行文庫篩選工作量極大;其次,由于cDNA片段不同,篩選過程中呈劣勢生長的菌株不容易得到篩選;最后篩庫同樣面臨單次篩選只能獲得文庫中極少部分的相互作用結果。為了適應基因組水平的相互作用篩選,人們開發了酵母雙雜交陣列篩選技術。
      陣列篩選法又可分為一對一陣列、高通量陣列法、亞庫對亞庫法。一對一陣列法含有不同BD-X的菌株和所有含不同AD-Y的菌株一一對應篩選。
      高通量陣列法是把所有不同ORF-AD集合成庫,然后與排成陣列的不同BD-X作用的篩選方法,其實質是誘餌數量較大情況下的陣列化文庫篩選。亞庫對亞庫法把總數較大的DBD-X和AD-Y的成員分別編號并分組,每組含一定數量的成員,然后集合每組成員形成亞庫(pool),再用獵物亞庫對誘餌亞庫一一作用,篩選陽性克隆。此法工作量大,獲得的陽性克隆的獵物和誘餌都需測序鑒定。
      2、規?;d體構建方法
      規?;湍鸽p雜交篩選需要構建大量的表達載體,因此載體構建工作的質量和速度對于后續的酵母雙雜交篩選至關重要。傳統的構建載體的方法是限制酶切-連接方法,可以有效地將目的片段插入載體,然而其操作時間長,需要酶切、連接兩步反應,構建成功后的重組質粒需要進行DNA測序來驗證其正確性,表達載體的構建過程中存在載體自連、連接困難等缺點,這些缺點使得限制酶切-連接方法不能用于高通量的載體構建。

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