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    介紹ChIP技術的三個實驗步驟

    發布時間:2022-01-21   點擊次數:154次
      在生理狀態下把細胞內的DNA與蛋白質交聯在一起,通過超聲或酶處理將染色質切為小片段后,利用抗原抗體的特異性識別反應,將與目的蛋白相結合的DNA的片段沉淀下來,以富集存在組蛋白修飾或者轉錄調控的DNA的片段,再通過多種下游檢測技術(定量PCR、基因芯片、測序等)來檢測此富集片段的DNA序列。
      ChIP-seq技術實驗步驟:
      染色質免疫共沉淀技術包括3個獨立的步驟,即固定、沉淀和檢測。
      第1步固定
      甲醛能有效的使蛋白質-蛋白質,蛋白質-DNA,蛋白質-RNA交聯,形成生物復合體,防止細胞內組分的重新分布。首先在體內用甲醛固定DNA和蛋白質復合物,需要注意甲醇的交聯時間,如果過長,細胞染色質難以用超聲波破碎,影響ChIP結果,而且實驗材料也容易在離心過程中丟失;交聯時間如果過短,則交聯不完全,產生假陰性。交聯反應可加入終止。然后用化學(微球菌酶)或者機械(超聲波)的手段將其隨機切成一定長度的染色質小片段(200~1000bp)。
      第2步免疫沉淀
      利用目的蛋白質或者目的蛋白質上標簽的特異性抗體,通過抗原和抗體反應形成DNA-蛋白質-抗體復合體,然后沉淀此復合體,特異性地富集目的蛋白結合的DNA的片段。
      第3步目的片段的純化與檢測
      經過熱處理及交聯,釋放共沉淀的DNA;再將DNA的片段純化后,對沉淀的DNA樣品進行檢測。目前檢測方法主要有3種:第1種是比較沉淀的模版與陰性和陽性對照PCR信號強度的普通PCR實驗,或者相對精確的定量PCR方法。第2種是將沉淀的DNA與DNA微陣列芯片雜交(ChIP-on-ChIP),以檢測多基因軌跡全部的相互作用。第3種是高通量DNA測序分析。

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