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    介紹EMSA實驗的三種方法

    發布時間:2022-01-13   點擊次數:198次
      凝膠遷移或電泳遷移率實驗(electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA)是一種體外研究DNA結合蛋白(轉錄因子)和其相關的DNA結合序列(靶標基因的啟動子序列)相互作用的技術,可用于定性和定量分析。
      通用蛋白質-DNA結合分析試劑盒(比色),用于測量核提取物中轉錄因子與DNA結合活性。在實驗中,含有靶向轉錄因子的DNA結合共有序列的標記的雙鏈寡核苷酸(寡核苷酸)與結合試驗緩沖液中的核提取物一起溫育。核提取物中活性形式的轉錄因子與其共有序列結合。然后將寡蛋白復合物捕獲到測定微孔上。靶蛋白可以通過高親和力抗體識別,并通過檢測抗體-顯色試劑反應系統進行比色測量。
      EMSA實驗根據實驗方案設計的不同,分為驗證型EMSA、競爭型EMSA、超遷移EMSA。
      一、驗證型EMSA
      用于驗證探針是否含有可與蛋白質結合的位點。
      探針與純化蛋白混合孵育,探針與蛋白結合與否,可以直接表明探針和蛋白的互做關系。蛋白提取液中蛋白質混雜,種類不單一,探針可能與多種蛋白結合。因此,探針與蛋白提取液混合孵育,可以驗證探針上是否含有蛋白結合位點,但是無法得知是何種蛋白與探針結合。
      二、競爭型EMSA
      與探針序列相同,不含修飾基團的DNA的片段稱為冷探針。
      在探針與蛋白質混合液中加入大量冷探針,冷探針含有和探針相同的DNA序列,會干擾探針與蛋白的結合。在電泳圖的相應位置處,電泳帶的的信號減弱或消失。
      探針和蛋白的結合未必是特異性結合,或者蛋白本身可能含有,二者均能產生假陽性的實驗結果。增加一個冷探針的干擾實驗,可以排除假陽性結果,增加實驗結果的準確性。
      三、超遷移EMSA
      超遷移EMSA利用到了與待檢測的目的蛋白特異性結合的抗體。
      如果蛋白質溶液不是單一的純化蛋白,無論是驗證型EMSA,還是競爭型EMSA,都無法證明和探針結合的蛋白質就是我們所預期的。在實驗體系中引入特異性抗體,用抗體特異性地結合蛋白-探針復合物,這就是超遷移EMSA。
      蛋白-探針復合物被抗體識別并結合,該三聚復合物在凝膠電泳中,遷移速率再次增大,電泳帶出現在蛋白-探針復合物的上方。
      超遷移EMSA是以競爭型EMSA為基礎的實驗方案。超遷移EMSA的實驗結果可以很好的驗證探針是否和蛋白結合,是否是特異性結合,與探針結合的蛋白是否是預期的蛋白質。

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